細胞懸浮培養(yǎng)是利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)生物制品的核心技術(shù)，是當前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式，其最大優(yōu)勢是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。但該技術(shù)目前在國內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用，生物制品生產(chǎn)仍主要采用病毒產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大的轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)方式。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，利用細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進行生物制品生產(chǎn)是生物制藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
1、懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用歷史和現(xiàn)狀
1962年，Capstick等率先對BHK21細胞馴化實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，并用于獸用疫苗生產(chǎn)。1967年，Van Wezel又開發(fā)了微載體并實現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞。到20世紀80年代，CHO細胞實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動著生物反應(yīng)器在生物制藥行業(yè)中的應(yīng)用，到20世紀末已進入萬升級規(guī)模。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個性化細胞培養(yǎng)基等技術(shù)的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設(shè)備的生物反應(yīng)器規(guī)模也趨向大型化和簡單化?，F(xiàn)在，全球10000L及以上體積的反應(yīng)器達一百多臺，最大已達25000L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C械攪拌式反應(yīng)器，主要為Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有。2007年全球銷售額最高的6大類生物技術(shù)藥物中，有5類是經(jīng)哺乳動物細胞表達生產(chǎn)的。縱觀國內(nèi)，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過110家，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的僅4家。一般獸用疫苗企業(yè)采用國內(nèi)自主開發(fā)的650 L和1200 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
2、懸浮培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)
懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要包括高表達細胞株的獲得、個性化培養(yǎng)基的研發(fā)、動物細胞反應(yīng)器及配套設(shè)施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個方面。
2.1 細胞與毒株的馴化
為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性，在生物反應(yīng)器中繁殖的病毒與細胞需要進行相互適應(yīng)選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對于細胞大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
為實現(xiàn)馴化的穩(wěn)定，通常由高密度細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向低密度細胞培養(yǎng)，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進行培養(yǎng)。細胞馴化時應(yīng)該注意保持細胞活力應(yīng)90%以上，測定細胞增殖能力的和表達分泌能力進行，避免馴化后的細胞表達特性發(fā)生變化。馴化后細胞的增殖能力、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。由于特定細胞的營養(yǎng)需求不同，實現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時需要選用合適的細胞培養(yǎng)基，有針對性地補充某些營養(yǎng)成分以滿足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無血清生長的特性。
2.2 細胞培養(yǎng)基的個性化
在大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)中，維持細胞高密度甚至無血清生長，細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)含量對細胞的增殖、維持至關(guān)重要。在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中，不同細胞營養(yǎng)代謝的特異性不同，細胞和病毒培養(yǎng)工藝不同，需要抗剪切力、滿足放大功能，還需要提高目標生物制品的穩(wěn)定性、表達量，這些均需要個性化培養(yǎng)基的支持。我國銷售的細胞培養(yǎng)基卻多為20世紀50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細胞培養(yǎng)基等，這些目錄產(chǎn)品難以滿足生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的技術(shù)要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術(shù)升級。從對人類和動物安全性的長遠考慮，生物制品生產(chǎn)越來越傾向采用無血清無動物組分培養(yǎng)基，因為無血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化、回收率高，國際上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無血清細胞培養(yǎng)基。
2.3 細胞培養(yǎng)工藝的研發(fā)
懸浮培養(yǎng)過程技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用主要是生產(chǎn)工藝的開發(fā)和工藝過程優(yōu)化，維持細胞生長和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中的作用同樣至關(guān)重要。
2.3.1懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng)技術(shù)按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養(yǎng)和貼壁細胞微載體懸浮培養(yǎng)。懸浮細胞可以在反應(yīng)器中直接生產(chǎn)增殖，細胞自由生長、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡單、培養(yǎng)操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細胞和球體接觸部位營養(yǎng)環(huán)境較差，培養(yǎng)、取樣觀察及放大工藝復(fù)雜，成本高。
雖然相對于懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)復(fù)雜，但與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢，能提高生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量和勞動效率，因此是貼壁細胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。常見的微載體有實體的Cytodex微載體、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時細胞貼附于載體內(nèi)部生長，表面細胞較少，難以使用細胞消化等方法將載體和細胞進行分離，且反應(yīng)器放大工藝困難，不適合非釋放病毒的培養(yǎng)。而Cytodex比較適應(yīng)罐倒罐的反應(yīng)器放大工藝，目前報道的貼壁細胞生產(chǎn)工藝的最佳形式是機械攪拌式反應(yīng)器實體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實現(xiàn)最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設(shè)計，其最佳工藝設(shè)計體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。
2.3.2懸浮培養(yǎng)方式
選擇反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)方式需要考慮細胞和病毒的關(guān)系、產(chǎn)物穩(wěn)定性、細胞培養(yǎng)基或添加物的選擇、細胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個因素。按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。
批培養(yǎng)能直觀反映細胞在生物反應(yīng)器中的生長、代謝變化，操作簡單，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細胞生長，細胞生長密度不高;流加培養(yǎng)操作簡單、產(chǎn)率高、容易放大，應(yīng)用廣泛，但需要進行流加培養(yǎng)基的設(shè)計;灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小，回收體積大，產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，利于保持產(chǎn)品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養(yǎng)基利用效率低、旋轉(zhuǎn)過濾器容易堵塞等。不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng)，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng)。同一生物制品由于其營養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒，低血清培養(yǎng)時采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無血清的維持液;而無血清培養(yǎng)過程中無需換液，配合流加培養(yǎng)可能效果更好。
3、細胞懸浮培養(yǎng)在畜禽疫苗中的應(yīng)用
目前疫苗免疫是控制動物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質(zhì)量，降低疫苗成本已成為各大動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點。工業(yè)化細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗是提高疫苗質(zhì)量，降低成本的有效手段。
3. 1 豬病毒病疫苗
狂犬病毒在2 L的生物反應(yīng)器繁殖，病毒最大滴度能夠達到1.38×108pfu/ mL，且生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量達到WHO要求。無血清微載體細胞培養(yǎng)有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)。同樣有不少關(guān)于細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)豬偽狂犬、豬藍耳病、豬口蹄疫、豬瘟、豬細小病毒病等疾病疫苗的報道。
3. 2 禽病毒病疫苗
禽類疫苗主要通過SPF雞胚生產(chǎn)，但雞胚生產(chǎn)疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產(chǎn)周期長，易污染，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個病毒毒株。因此，SPF雞胚生產(chǎn)疫苗的效率很低。我國已經(jīng)能夠通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)出符合《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》的雞傳支H120細胞弱毒苗。楊濤等也報道了禽流感病毒在MDCK細胞中大規(guī)模增殖規(guī)律。國外有不少關(guān)于細胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽馬立克病毒、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報道。
4 展望
應(yīng)該認識到，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用只是搭建了一個升級工藝的平臺，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動力是新獸藥、新疫苗、新工藝以及配套技術(shù)的創(chuàng)新。
例如無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和無血清培養(yǎng)病毒生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染或馴化技術(shù)實現(xiàn)貼壁細胞的懸浮培養(yǎng)構(gòu)建;新宿主細胞表達品種開發(fā)，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細胞表達或是開發(fā)一種高效表達的宿主細胞適應(yīng)幾種產(chǎn)品的表達等?？偠灾?，整合行業(yè)力量，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的升級換代是未來幾年我國生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點。這個過程應(yīng)重視成熟技術(shù)、成功率，減少和避免時間、資金、人力等資源的浪費，減少機會成本，搶占市場先機。懸浮培養(yǎng)技術(shù)的升級將導(dǎo)致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢，有實力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥、新技術(shù)研發(fā)為基礎(chǔ)和核心競爭力，同時借助資金實力整合制造和營銷體系，成為真正意義上的龍頭。
來源：中國獸用生物制品