（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所2 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司）
基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-43），福建省農(nóng)業(yè)五新工程項目（閩發(fā)改投資（2012）931號）
摘要：目的：觀察十二烷基硫酸鈉（SDS）肌注對家禽的副作用；建立檢測禽霍亂莢膜粗提物中的SDS殘留量的方法。方法：肌肉注射0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，觀察家禽的全身及局部反應(yīng)。不同濃度SDS溶液與吖啶橙混合，作用后甲苯抽提，測定499nm的光吸收值，建立回歸方程。根據(jù)待檢品的光吸收值求出其SDS濃度。結(jié)果：肌注后1天內(nèi)，所有家禽在注射部位均有輕微的壓痛表現(xiàn)，1天后緩解，繼續(xù)觀察至14天，未見家禽表現(xiàn)全身和局部反應(yīng)。 當(dāng)SDS的濃度在0.001％~0.005％時，與OD499呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9969。結(jié)論：0.01％和0.05％的SDS溶液肌注，對家禽沒有副作用。吖啶橙-分光光度法可以用來檢測禽霍亂莢膜粗提物中的SDS殘留。
關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌 莢膜 吖啶橙 SDS
禽霍亂，又名禽巴氏桿菌病、禽出血性敗血癥，是侵害家禽和野禽的一種慢性或急性接觸性傳染病。該病急性發(fā)作時表現(xiàn)敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，慢性型則病情緩和，通常只引起肉髯或關(guān)節(jié)等局部的感染。許多抗菌藥物能迅速控制本病，但停藥后易復(fù)發(fā)，造成的損失極大。林世棠等以特殊工藝提取其莢膜，制成禽霍亂莢膜亞單位疫苗，近期免疫保護(hù)率為80％以上[2-7]。在禽多殺性巴氏桿菌莢膜的提取過程中，需加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），雖然在后續(xù)的工藝中含有去除SDS的步驟，但其殘留是不可避免的。過量的SDS會對機(jī)體產(chǎn)生副作用，人用生物制品中該殘留量應(yīng)控制在0.05％左右的安全范圍內(nèi)[8、9]。SDS殘留對家禽的影響尚未見報道，本試驗觀察0.01％和0.05％的SDS溶液肌注后，SPF雞、麻鴨和長樂灰鵝的全身及局部反應(yīng)，為禽用生物制品中SDS的殘留范圍規(guī)定提供依據(jù)，同時還建立了檢測莢膜提取物中SDS殘留的方法，現(xiàn)報道如下。
1 材料與方法
1.1儀器
UV1600型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司。
1.2 試劑及溶液的配制
吖啶橙，Biosharp公司產(chǎn)品；SDS，Sigma公司產(chǎn)品；NaHSO4·H2O，甲苯，均為分析純。
稱取6.9000g的NaHSO4·H2O加入雙蒸水溶解，定容至100mL，為0.5M NaHSO4溶液。
稱取0.4000g的吖啶橙，加入0.5M NaHSO4溶液溶解，定容至100mL，為0.4％吖啶橙溶液。
稱取0.1000g的SDS，加入雙蒸水溶解，定容至100mL，為0.1％的SDS溶液。取少量稀釋成0.01％和0.05％的濃度，用于動物試驗；取少量稀釋成0.001％、0.002％、0.003％、0.004％和0.005％，作為檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。
待檢品為禽多殺性巴氏桿菌莢膜粗提物，批號為20131211、20131215、20131220和20131228，由本實驗室制備。
1.3 不同濃度SDS溶液對禽類的影響
選擇30日齡的SPF雞、麻鴨和長樂灰鵝，詳細(xì)分組見表1，0.01％的SDS溶液（濾膜除菌）、0.05％的SDS溶液（濾膜除菌）、滅菌生理鹽水，分別肌注10羽實驗動物，每羽于左、右腿部肌肉各注射1mL。同條件隔離飼養(yǎng)14天，提供充足的飼料和飲水。期間每日觀察實驗動物的臨床狀況，包括精神狀態(tài)、行為活動、眼睛和鼻孔分泌物、采食和排便情況等；局部不良反應(yīng)包括紅腫、硬結(jié)、瘙癢和壓痛等。分別于肌注后1天、3天和5天各撲殺2羽，觀察注射部位的肉眼變化。
1.4 SDS濃度與光吸收值的對應(yīng)關(guān)系
取100μL標(biāo)準(zhǔn)品于帶塞試管中，加入100μ L0.4％吖啶橙溶液混勻。加入3mL甲苯后塞緊試管，劇烈振蕩3min，3000g離心5min，吸上清測定499nm處的光吸收值，用雙蒸水作參比。每個標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3個重復(fù)，取平均值。以SDS濃度為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，求相關(guān)系數(shù)，建立回歸方程。
1.5 待檢晶SDS殘留量的測定
方法同1.4，每個待檢品進(jìn)行3個重復(fù)，取平均值。將光吸收值代人回歸方程，計算待檢品的SDS濃度。
2 結(jié)果
2.1 SDS溶液對禽類的影響
0.01％的SDS溶液、0.05％的SDS溶液和生理鹽水注射后，各組動物的臨床表現(xiàn)相似，精神狀態(tài)良好，行為活動正常，眼睛和鼻孔無異常分泌物，采食和排便正常。肌注后1天內(nèi)，所有動物在注射部位均無出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)，但有輕微的局部壓痛表現(xiàn)。肌注后1天，局部壓痛消失，觀察到肌注后14天，注射部位仍無硬結(jié)。肌注后1天撲殺，各試驗組表現(xiàn)相同，僅在注射部位見小出血點。肌注后3天撲殺，各試驗組表現(xiàn)相同，在注射部位肉眼見不到異常變化。肌注后5天撲殺，各試驗組均沒有肉眼可見病變。
2.2 SDS濃度與光吸收值的回歸曲線
各標(biāo)準(zhǔn)品的平均光吸收值見表2，以SDS濃度為橫坐標(biāo)，以光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，當(dāng)SDS的濃度在0.001％~0.005％時，相關(guān)系數(shù)為0.9969，回歸方程為y=50.4x-0.002。
2.3 待檢品SDS殘留量的計算
各待檢品的平均光吸收值見表2，全部在0.043~0.247，直接將光吸收值代人回歸方程，計算出的SDS殘留量見表2，4批莢膜粗提物的SDS殘留量全部低于0.005％，遠(yuǎn)低于目前0.05％的殘留標(biāo)準(zhǔn)。
3 討論
目前人用生物制品SDS的殘留量公認(rèn)的安全指標(biāo)為0.05％，但獸用生物制品SDS的殘留量安全指標(biāo)沒有明文規(guī)定。本試驗以30日齡的SPF雞、麻鴨和長樂灰鵝為實驗動物，肌肉注射2 mL的0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，除第一天有局部壓痛外，未見全身反應(yīng)及其他的局部反應(yīng)，說明家禽肌肉注射0.05％的SDS溶液是安全的。
吖啶橙-分光光度法的原理是用吖啶橙溶液與SDS結(jié)合，產(chǎn)生SDS-吖啶橙復(fù)合物，再用甲苯從水溶液中抽提出來進(jìn)行比色測定[10]。許國杰等（2002）和吳慶洲等（2010）也將該方法用于重組人白細(xì)胞介素和雙質(zhì)粒疫苗中SDS的檢測，證實是可行的。本試驗參考他們的方法，當(dāng)SDS的濃度在0.001％~0.005％時，相關(guān)系數(shù)為0.9969，此時，OD吸收值與SDS的濃度相關(guān)性非常強。測定了4批禽多殺性巴氏桿菌莢膜粗提物的SDS殘留，均在0.005％以下，對家禽是安全的。
參考文獻(xiàn)
[1]Y.M.Saif主編．蘇敬良，高福，索勛主譯．禽病學(xué)（第十二版）[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：871-893．
[2]林世棠，陳月英，陳萍．禽多殺性巴氏桿菌莢膜脂多糖蛋白復(fù)合物免疫原性的研究-提純及免疫試驗[J]．家畜傳染病，1984,6(3)：11-14．
[3]林世棠，陳月英，陳萍．禽多殺性巴氏桿菌莢膜多糖-蛋白復(fù)合物對鴨的安全性和免疫原性試驗[J]．獸醫(yī)科技雜志，1984,14(12)：17-21。
[4]林世棠，陳月英，陳萍，等．禽多殺性巴氏桿菌強毒株及其經(jīng)鹽類浸提胞壁莢膜抗原后電鏡顯微結(jié)構(gòu)的觀察[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1985,16(3)：214-215．
[5]林世棠，陳月英，陳萍，等．禽霍亂莢膜亞單位菌苗的研究II．免疫效力、免疫期和產(chǎn)蛋量影響的初步試驗[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1986,17(4)：271-275．
[6]林世棠，陳月英，楊蘇，等．禽霍亂莢膜亞單位菌苗的研究III．禽多殺性巴氏桿菌胞壁莢膜抗原的若干理化特性[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1988,19(3)：195-200．
[7]林世棠，陳月英，陳萍，等．禽多殺性巴氏桿菌莢膜亞單位疫苗對鴨的免疫研[J]．福建省農(nóng)科院學(xué)報，1989,4(1)：1-9．
[8]許國杰，張淑子，張桂英．應(yīng)用吖啶橙-分光光度法檢測重組人白細(xì)胞介素2制品中的SDS含量[J]．中國生物制品學(xué)雜志，2002,15(1)：51-52．
[9]吳慶洲，饒桂榮，楊富強，等．治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗制品中SDS殘留量的測定[J]．華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2010,24(1)：1-2．
[10]Sokoloff RL，F(xiàn)rigon RP．Rapidspectrophotometric assay of dodecyl sulfate using acridine orange[J]．Anal Biochem，1981，118(1)：138-141．